段琳,赵文锋,丁建坤,吴梧桐,刘景晶
(中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京210009)
摘要:卵黄抗体(IgY)是禽类产生于血清中的免疫球蛋白,并在其受体介导下转移到卵黄中提供给新生个体被动免疫。IgY因其制备简单、成本低、可规模化生产,已被开发成功能食品、保健品、消毒剂等;诊断与治疗性lgY也将在临床上得到广泛的应用。
关键谒:卵黄抗俸:开发;I恪床应用
中图分类号:TQ464.7
文献标识码:A
文章编号:1005-167812010)03旬212-04
The present development status and application perspective ofegg-yolk antibody(IgY)
DUAN Lin,ZHAO Wen-feng,DING Jian-kun,WU Wu—tong,LIU Jing-jing
(School of L谵Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing,2 1 0009,China)
卵黄抗体(IgY)又称卵黄免疫球蛋白,在特异性抗原刺
激下由禽类B淋巴细胞产生并转移到卵黄中的多克隆抗体。lgY以其性质稳定、特异性强、制备简单、成本低、可规模化生产而倍受关注。目前已有大量添加lgY的产品如发酵酸奶、功能性食品、卫生消毒产品及化妆品等上市销售。lgY应用于医疗诊断及治疗通过临床验证也显示出良好效果。lgY的应用范围不断扩大,可以作为亲和配基,催化抗体等。本文就IgY的作用机理、开发现状、临床应用进行综述。
l
IgY及其作用机理
IgY是由特异性抗原免疫禽类,产生于卵黄中的_y免疫球蛋白。1893年Klemperer用试验首次证明特异性抗原免疫鸡后。抗体会转移到卵黄中。Leslie和B.Clemlgy(1969)提出卵黄中的抗体以IgY表示。20世纪80年代以来IgY开始广泛应用,lgY技术即lgY的制备和应用也逐渐成熟。IgY的制备包括选择抗原、佐剂、免疫方案(抗原剂量、免疫方式、次数和间隔期等)以及IgY的分离、纯化与储存。在实际应用中.19Y被制成卵黄粉或精制成抗体注射液。
lgY在食品、医药、生物等方面的应用越来越广泛,其作用机理逐渐被阐明和完善。口服IgY已被证明能有效替代抗生索治疗因耶尔森菌、肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、幽f】螺杆菌等感染引起的胃肠道疾病。抗肠道细菌lgY
可能主要通过以下作用环节达到抗菌的作用⋯:特定病原菌
lgY能直接黏附于病原菌的细胞壁上,抑制病原菌的生长;
针对病原菌的菌毛和鞭毛lgY可黏附于细菌的菌毛和鞭毛
上,使病原菌不能黏附于肠道黏膜上皮细胞,妨碍其运动、游
走;一部分IgY在肠道消化酶作用下。降解为可结合片段,被
肠道吸收后进入血液能与特定病原菌黏附因子结合,使病原
菌不能黏附易感细胞而失去致病性。IgY也显示较好的抗
真菌、抗病毒效果。白色假丝酵母菌是条件致病真菌,能够
导致口腔和阴道黏膜感染。抗白色假丝酵母菌lgY可与白
色假丝酵母菌特异性结合,抑制其游动、生长和繁殖;阻断白
色假丝酵母菌黏附素与机体组织、细胞中的受体结合;在无
血清的环境中抑制白色假丝酵母菌生物被膜(biofilm)的形
成忙’;同时还能吸引巨噬细胞,加强吞噬作用,消除局部感
染,阻止病原的播散而达到治疗目的¨1。抗轮状病毒卵黄免
疫球蛋白主要是通过改变病毒表面的构型,阻止病毒吸附于
机体细胞以及增强巨噬细胞的吞噬作用H1。
2
IgY的开发现状
美国、日本、德国等在IgY研究开发中处于领先地位。Gallus immunotech、GenWay、IGY等公司致力于lgY的开发研究,并获得较为可观的经济效益和社会效益。美国雅臣药业集团(JasonMedicalHoldings,lnc.USA)是全球第一个将IgY技术产业化、商品化的公司。该公司有关IgY技术的技术发明专利有27项,研发成功并商品化的IgY系列产品共有22种。“奥丽汀健齿露”、“奥丽汀lgY免疫牙膏”、“免力快喉友喷剂”、“抗幽门杆菌和球菌复合IgY幽净胶囊”等已经投放市场并大量销售。国内lgY的研究开发也处于国际上较为领先的水平。湖南安邦制药有限公司主持的“卵黄抗体技术(IgY系列产品)深度开发”是2009年长沙市的重点项目之一,同时该公司引进国外IgY生物抗体技术,生产妇科用“瑞丽女人抑菌丹”第二代产品,开创了国内首家应用IgY生物制剂的绿色疗法治疗预防妇科疾病。“特异性抗CA IgY
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新璎制剂的研发与应用”是南昌大学产业化项目,已经对特
异性抗CA lgY泡腾片的药效作用,进行了临床前研究,并已
申请专利”J。大连赛姆生物工程技术公司的研究项目“lgY
在疾病防治方面的应用”已完成中试。目前,大量lgY已经
商品化。
2.1合lsY的功能性食品和保健品
美国食品和药品管理局(FDA)认为,lgY作为功能食品
比作为药物更有利,并将其列人“一般公认安全物质(Gen.
erally Accepted As Safe)”范畴,因此如同每日饮用牛奶一
样,消费者可放心食用卵黄抗体。lgY可以添加到婴幼儿、
中老年人的食品中,提高人体对各种疾病的抵抗力。用幽门
螺杆菌的致病物质尿酶免疫鸡制备lgY,经65℃巴氏消毒
30 min后添加到含有双歧杆菌和乳酸杆菌的酸奶中,终浓度
为1%。对42名经”c尿素呼气试验(UBT)确认为感染幽
门螺杆菌的患者服用该酸奶,每次150 mL(含lgY-尿酶15
mg),3次/d,持续4周。试验组与未服用前相比UBT降低
了39.33%,对照组即没有添加IgY的酸奶服用组与未服用
前没有明显的差别【6 J。这种新型的酸奶作为营养食品已被
开发进行大规模的生产,已在日本、中国台湾、韩国等地
上市。
台湾华肝医药股份有限公司以专业化养鸡生产平台,成
功开发4种含有IgY的功能性食品:肠病毒71型IgY抗体、
常见肠道致病菌lgY抗体、引起蛀牙的转糖lgY抗体及绿脓
杆菌lgY、引起消化性溃疡的幽门螺杆菌IgY抗体。
江西中德联合研究院与葫芦岛爱克生物工程有限公司
运用现代免疫生物工程技术.从经轮状病毒免疫鸡卵黄中提
取并纯化的多种生物活性因子,采用冷冻干燥等工艺生产的
纯天然口服抗轮状病毒免疫球蛋白(商品名“百贝宁”),从
2001年七市到现在,经临床试验发现“百贝宁”治疗轮状病
毒性肠炎疗效显著,服用方便,治疗过程中未发现毒副作
用‘”。
2.2舍IgY的消毒产品
美国雅臣药业集团和广东省大日生物化学药业有限公
司联合研制的用金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、B2溶血性
链球菌、G簇溶血性链球菌、肺炎球菌等细菌复合抗原免疫
的鸡蛋黄中提取特异性IgY,制成水溶性薄荷味喷雾剂(效
价为512)(商品名:喉友口腔抗菌液),用于口腔和咽喉的
消毒。施建绒埔1将160例过敏性鼻炎患者随机分为试验组
和对照组,试验组每日用喉友口腔抗菌液喷鼻,对照组用抗
组胺药和雷诺考特鼻喷剂治疗。结果表明,用“喉友口腔抗
菌液”对过敏性鼻炎的总有效率达到86.25%。
还有添加lgY用于预防龋齿的“贝可丽健齿”喷剂以及
针对消灭或抑制各种导致妇科感染性疾病的细菌和霉菌的
“维洁斯”TM洁阴抑菌泡沫剂等消毒产品也已上市销售。
2.3基于IgY的分离检潮试荆盒
人血浆成分复杂,含有上万种蛋白质,其中自蛋白
(HSA)、IgG等12种高丰度蛋白占到了血浆总蛋白的90%
以上。高丰度蛋白的存在,影响血浆中一些低丰度蛋白的检
出,而这些低车度蛋白很可能是疾病治疗的靶标和诊断的标
志。获得HSA和IgG的特异性IgY。偶联于金磁微粒表面。
加入人血浆样品后,99%以上的抗体固定在金磁微粒表面,
取上清进行SDS—PAGE检测,该金磁微粒可有效的去除血浆
中大部分高丰度蛋白HSA及IgG—J。贝克曼库尔特公司利
用此技术开发出lgY蛋白质组份分离试剂盒:Proteome Lab
lgY.12和ProteoineLab lgY—R7,分别用于从人及其他灵长类
体液和啮齿动物体液中分离高丰度蛋白。GenWay是全球处
于领先地位的lgY抗体研发、生产和销售公司,提供大量鸡
抗体产品,特别是提供基于IgY的El。ISA各种试剂盒,用于
分析血浆和血清样品以及药物靶标的发现。
2.4其他产品
将IgY添加到化妆品中可抵制多种细菌和病毒,消除主
要细菌引起的痤疮,保护皮肤,如韩国“Acfine”系列产品。
还有将IgY添加到牙膏及口香糖中,预防和治疗龋齿。
3临床诊断和治疗性IgY
3.1诊断性IgY
IgY具有不与金色葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白相
结合,不与哺乳动物Fc受体、类风湿因子结合,不与人抗或
鼠抗体交叉反应,不激活补体等特点。由于禽类和人亲缘关
系较远,种系差别大,使得lgY在检测诊断上具有稳定性、特
异性和灵敏度高、免疫干扰小、背景低等优点。因此,lgY已
应用于琼脂扩散试验、乳胶凝集试验、荧光免疫试验、ELISA、
免疫组化、胶体金标记等免疫学试验以检测病毒、细菌、寄生
虫感染以及心血管疾病和癌症。
3.1.1
病毒引起疾病的诊断 史继静等¨驯用纯化的编码
HIV·lgag p7、p6的前体蛋白NCpl5免疫蛋鸡,制备的IgY具
有较强的免疫反应性,能够与HIV·l病毒蛋白NCpl5特异
性结合,从而为HIV·1诊断试剂盒开发及HIV-1实验研究奠
定基础。核衣壳(NP)是SARS病毒的主要结构蛋白,病人
感染1周后,在病人的血浆和鼻明呼出物中大量出现。通过
克隆NP,免疫鸡获得NP特异性抗体,用于免疫检测分析,对
NP的检出限是10 pg/mL,是所用检测方法中最敏感的⋯1。
以3种灭活的天花病毒(vaccina virus,calpox virus和cowpox
virus)为免疫原,分别免疫注射3组实验蛋鸡制备抗体。用
特异性的IgY与磁珠结合,并在模拟样本中用于天花病毒的
PCR检测,可达到纯化病毒、增强实验敏感度的效果¨“。杨
军等¨川制备出针对乳头瘤病毒16 Ll蛋白(human papillo·
mavirusl6
type
L1 main
capsid protein,HPVl6 LI)的高效价特
异性lgY,可用于HPVl6LI蛋白的细胞学检测,为IgY抗体
在免疫组织化学检验中的应用提供实验依据。
3.1.2血吸虫病的诊断血吸虫病是一种严重危害人类健
康的人兽共患寄生虫病。以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(
SEA)免疫海南蛋鸡。制备IgY。以双抗体夹心酶联免疫吸附
试验(S-ELISA)法,检测急、慢性血吸虫病病人和健康人血
清,并与常规检测抗体的酶联免疫吸附试验法(NEA-ELISA)
做比较显示S-ELISA法检测急性血吸虫病人循环抗原的阳
性率为100%,慢性血吸虫病人循环抗原的阳性率为
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84,4%,健康人的特异性为96%【l”。同时显示两种方法血
吸虫病的检出率差异无统计学意义。Lei等¨纠采用基于lgY
的免疫磁珠ELISA反应检测血浆中的循环抗原的量也可以
用来评价采用吡喹酮治疗后的效果。
3.1.3用于心血管疾病的诊断研究表明内源性畦巴因
(ouabain)与多种心血管疾病密切相关。但是。由于哇巴因
在机体内的含量极低,在正常人血浆中含量甚微,目前多选
用放射性免疫检测,存在放射性污染和试剂昂贵的缺点。利
用鸟类和哺乳动物的种系差别较大,将哇巴因.牛血清白蛋
白耦联物免疫蛋鸡制备IgY。可对哇巴因进行检测。结果表
明鸡抗体lgY比兔抗体IgG的检测特异性、准确性均高,在
一定程度上提高了哇巴因检测水平¨“。
3.1.4用于癌症的诊断HER2和端粒酶是乳腺癌诊断的
标志因子,用HER2和端粒酶免疫母鸡产生抗HER2和端粒
酶的卵黄抗体代替哺乳动物多抗进行检测,与哺乳动物的
lgG和IgM相比,IgY更加灵敏¨”。Xiao等【1引构建了IgY和
单壁碳纳米管(SWNT)复合物HER2 IgY—SWNT,其结合了
SWNT的共振拉曼散射及在700一l
100
nm近红外范围内很
强的吸收特征和IgY的特异性、敏感性,在体外能够专一性
检测和光热消融破坏HER2标志的乳腺癌细胞,有望成为新
的癌症检测和治疗手段。
3.2处于临床研究阶段的治疗性IgY
口服lgY用于被动免疫治疗,具有广阔的前景。目前多
数尚处于临床前和临床研究阶段。其中最成功的是治疗囊
性纤维化病(CF)lgY已完成II期临床试验,进入Ⅲ期临床。
慰17名瑞典病人口服抗铜绿假单胞菌IgY进行长达12年
的稿床治疗硅示出其具有良好的作用,而且口服对肺功能没
有影响,病人的体重指数值接近正常‘19]。Nilsson等Ⅲ1通过
观察1个口服lgY 10多年的临床病例指出长期口服特异性
抗铜绿假单胞菌lgY进行免疫治疗有效且没有任何的副作
用。抗铜绿假单胞菌[gY能够阻止铜绿假单胞菌的感染,但
存在全菌抗原和其他的细菌的交叉反应,有町能降低lgY的
治疗效果。以抗假单胞菌鞭毛抗原免疫获得IgY能够降低
假蕈胞菌的黏附,使病人的感染率和对抗生素的依赖降低,
同时抗鞭毛蛋白IgY也可以降低鞭毛蛋白引起的cF病人的
炎症反应”“。
采用低分化腺胃癌的P1lO癌蛋白作为抗原免疫SPF
鸡,从卵黄中提取抗体IgY作为蓖麻毒蛋白的导向载体制备
IgY·Ricin A。能够选择性地识别胃肠道系统肿瘤.诱导肿瘤
细胞的程序性死亡,最终杀死肿瘤细胞。IgY-Ricin A现已获
国家发明专利‘22]。
4
lgY的其他应用研究
IgY是一种较为理想的催化抗体旧“。采用过渡态类似
物4一(羟基(2-萘氧基)磷酰基)丁酸(HNPBA)为半抗原,和
BSA偶联为全抗原免疫鸡,制备IgY,以乙酸-2一萘酯为底物
验证其催化活性,测得Kcat/Kuncat一2×104。显示IgY具有
较高的催化活性。IgY用胰蛋白酶消化后,其(Fab’)片段的
催化活性与lgY相似。IgY还可以作为亲和配基,用于分离
纯化抗原。将纯化后的抗BSA特异性IgY为介质亲和分离
胎牛血清中的BSA,分离后的BSA纯度可达电泳l条带,明
显高于市售产品‘圳。
目前对于lgY的规模化生产和临床应用,还有许多问题
尚待解决,如生产工艺的稳定性、质量标准的制定、口服lgY
在体内的动力学研究、口服制剂在胃肠道中的稳定性等。随
着对lgY研究的不断深入和IgY生产技术的发展,IgY的应
用前景将越来越广阔,有可能成为一类新型的生化药物。
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